دیاکو رسولی محمود سلوکی براتعلی فاخري صدیقه اسمعیل زاده بهابادي

Transcript

1 مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی دوره سوم شماره 1 بهار و تابستان 1393 اثر منگنز و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن منتون ردوکتاز و میزان منتول صفحه 1-8 در گیاه دارویی نعناع فلفلی The effect of manganese and salicylic acid on gene expression of Menthone reductase and menthol content in Mentha piperita *1 دیاکو رسولی محمود سلوکی براتعلی فاخري صدیقه اسمعیل زاده بهابادي Diako Rasouli 1*, Mahmood Solouki 2, Barat Ali Fakheri 2, Sedigheh Esmaeilzadeh Bahabadi 1- کارشناسی ارشد بیوتکنولوژي کشاورزي گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژي دانشکده کشاورزي دانشگاه زابل 2 -دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژي دانشکده کشاورزي دانشگاه زابل 3- استادیار گروه زیست شناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه زابل 1- M.S.c of Agriculture Biotechnology, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol. 2- Associated Professor, Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol. 3- Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, University of Zabol. چکیده * نویسنده مسي ول مکاتبات پست الکترونیکی : diakorasouli@yahoo.com (تاریخ دریافت: - 93/6/17 تاریخ پذیرش: 93/9/15) به منظور بررسی اثر منگنز و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن منتون ردوکتاز (MR) و میزان منتول در واژههاي کلیدي بیان ژن منتول ردوکتاز منتون Mentha piperita گیاه نعناع فلفلی آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح بلوكهاي کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتورهاي آزمایش شامل زمان (1 3 و 5 روز بعد از اعمال تیمار) و تیمار (منگنز با غلظت 500 میکرو مولار و اسید سالیسیلیک با غلظت یک میلی مولار) انتخاب شدند. نتایج تجزیه آماري دادهها نشانداد اثر منگنز و اسید سالیسیلیک در طول سه زمان تا ثیر معنیداري بر بیان ژن MR و میزان منتول داشتند. کمترین میزان بیان ژن MR و میزان منتول تحت تا ثیر منگنز در روز پنج بعد از اعمال تیمار بود که اختلاف معنیداري با شاهد داشت. بیشترین میزان بیان ژن MR و میزان منتول نیز تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک در پنج روز بعد از اعمال تیمار مشاهدهشد. نتایج اثر متقابل منگنز و اسید سالیسیلیک نشانداد که اسید سالیسیلیک تا حدودي باعث کاهش سمیت ناشی از منگنز هم در بیان ژن MR و هم در میزان منتول شد. نتایج کلی این آزمایش بیانگر آن بود که ارتباط مستقیمی بین ژن MR و میزان منتول در گیاه نعناع فلفلی وجود داشت بهطوريک ه با گذشت زمان با افزایش بیان ژن MR تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک میزان منتول نیز افزایش یافت درحالی- که تحت تا ثیر منگنز هم بیان ژن MR و هم میزان منتول کاهش نشانداد. از طرفی مشاهدهش د که اسید سالیسیلیک به عنوان یک هورمون قوي عملکرده و باعث تعدیل اثر منگنز در بیان ژن MR و میزان منتول در گیاه نعناع فلفلی شد.

2 مقدمه دهد. عوامل مو ثر بر کیفیت اسانس گیاهان نیز ممکن است با تا ثیر Kjonaas نعناع فلفلی با نام علمی.L Mentha piperita متعلق به خانواده آنزیمهاي بر و همکاران شوند. عمل وارد ذکرشده Lamiaceae است. این گیاه گونهاي هیبرید است و از تلاقی بین (1982) در پژوهشی به بررسی متابولیسم مونوترپنها و تشکیل گونههاي M. aquatica و M. spicata حاصل شدهاست. بومی منتول و ني ومنتول از منتون توسط آنزیمهاي دهیدروژناز در برگ مناطق معتدله دنیا به ویژه اروپا آمریکاي شمالی و شمال آفریقا است اما امروزه در سراسر دنیا کشت میشود ) al., Singh et نعناع فلفلی پرداختند و عنوان کردند که منتول اصلیترین ترکیب اسانس نعناع فلفلی بوده که توسط آنزیم منتون ردوکتاز از منتون 1/5 نعناع فلفلی محتوي 1/2 تا درصد روغنهاي فرار تولید میشود. چگونگی تنظیم روند انباشته شدن مونوترپنها در.(2011 است که ترکیبهاي اصلی آن را منتول منتون منتوفوران متیل نظر از نیز نعناع برگ فیزیولوژیک است شده مشخص (1989 al.,.(gershenzon et از طرفی مشخصات ملکولی توالی استات و غیره تشکیل میدهد. (1985.(Klayman, منتول جزء اصلی اسانس نعناع فلفلی است و شناخته شدهترین آمینواسیدي و نقش آنزیم منتون ردوکتاز نعناع فلفلی در تشکیل مونوترپن است که هم بهعنوان یک ترکیب خالص از مواد تشکیل دهنده و هم یک جزء از روغنهاي ضروري گیاهان گونه منتول برگ مشخص شده است (2005 al.,.(davis et تولید متابولیتهاي ثانویه در گیاهان دارویی تحت کنترل عوامل.(Bauer et al., 1997) از خانواده Lamiaceae است ژنتیکی است از طرفی عوامل محیطی بهویژه شرایط تنشزا مانند Mentha منتول داراي خاصیت تسکین دهنده است و براي دردهاي فلزات سنگین نقش عمدهاي در کمیت و کیفیت این مواد به عهده موضعی مفید و ضدعفونی کننده است ) Barbera, Macro and دارند (2007 al.,.(bupesh et منگنز یکی از عناصر ضروري و.(1990 در مسیر بیوسنتز ترپنها موسوم به مسیر متیل اریتریتول فسفات (MEP) منتول طی هشت مرحله تولید میشود که ابتدا ایزوپنتنیل دي فسفات (IPP) و دي متیل الیل دي فسفات (DMAPP) بوسیله آنزیم ژرانیل دي فسفات سنتاز (GPPS) به ژرانیل دي فسفات (GDP) تبدیل میشود و سپس بوسیله آنزیم لیمونن سنتاز (LS) حلقوي شده و به لیمونن تبدیل میشود لیمونن هم طی یک سري واکنشهاي اکسید و احیاء و ایزومریزاسیون به منتون تبدیل میشود. منتون هم تحت تا ثیر آنزیم منتون ردوکتاز (MR) یا منتول دهیدروژناز که وابسته به NADPH است به منتول تبدیل کممصرف در تغذیه گیاهان محسوب شده که فراوانی آن در گیاه بهصورت فلز سنگین عمل کرده و باعث ایجاد مسمومیت میشود 2005) Khosropanah,.(Haji boland and از جمله مهمترین علاي م مسمومیت منگنز در اندام هوایی توقف رشد کلروز بین رگبرگی کاهش کلروفیل و درنتیجه کاهش مواد مو ثره گیاه است.(Blamey et al., 1999) در پژوهشهاي صورت گرفته توسط Grattan و (1999) Grieve مشخص شد که تنش فلزات سنگین باعث برهمزدن تعادل تغذیه- اي و کاهش متابولیتهاي ثانویه در گیاهان میشود. آنها بیان کردند با تکمیل عناصر مورد نیاز از طریق خاك یا محلولپاشی اجزاء تشکیل بیوسنتز مسیر میتوان وضعیت رشد و در نتیجه مواد مو ثره گیاه را تا حدي میشود 2005) al.,.(croteau et دهنده اسانس در گیاه مورد پژوهش مسیري چند آنزیمی است که بهبود بخشید. امروزه با توجه به ملاحظات زیست محیطی استفاده میتواند مقدار آنزیمها این از یک هر فعالیت مواد از یک هر از اسید سالیسیلیک براي بهبود خصوصیات کمی کیفی و موجود در اسانس به خصوص ترکیبات اصلی را تحت تا ثیر قرار شیمیایی محصولهاي زراعی دارویی و باغی رواج پیدا کرده 2 مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان 1393

3 است. اسید سالیسیلیک به خاطر نقشهاي متنوع تنظیمکنندگی در سه فلفلی در زمان مختلف روز بعد از پنج و سه یک بصورت سوختو-ساز گیاه و القاء بیان ژن یک هورمون گیاهی قوي محلولپاشی با منگنز و اسید سالیسیلیک برداشت شد و تیمار نیز شناخته شده است که بهعنوان یک مولکول سیگنالی نقش کلیدي شامل منگنز به صورت سولفات منگنز (MnSO4) در غلظت 500 مهمی را در تنظیم فرآیندهاي فیزیولوژیکی متابولیتهاي ثانویه و میکرومولار (2012 al., (hashemi et اسید و در سالیسیلیک مولار 2009) al., (sayyari et مقاومت گیاه به تنشهاي زیستی و غیر زیستی دارد ) al., He et میلی یک غلظت بود. همچنین به 2005). بنابراین در این تحقیق اثر منگنز به عنوان یک قلز سنگین منظور بررسی اثر متقابل منگنز و اسید سالیسیلیک ابتدا منگنز و به و اسید سالیسیلیک به عنوان یک القاء کننده گیاهی بر بیان ژن اسید روز بعد یک فاصله سالیسیلیک اعمال و در زمان سه منتون ردوکتاز که در مسیر بیوسنتز منتول دخالت دارد مورد پژوهش قرار گرفت. بهطورکلی هدف از این تحقیق بررسی رابطه مقدار منتول با بیان ژن منتون ردوکتاز تحت تا ثیر منگنز و اسید سالیسیلیک است. مواد و روشها کشت ریزوم جهت بررسی اثر منگنز و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن منتون ردوکتاز و میزان منتول در گیاه دارویی نعناع فلفلی آزمایشی در قالب فاکتوریل بر پایه طرح بلوكهاي کامل تصادفی با سه تکرار در پاییز 1392 در پژوهشکده زیست فناوري (بیوسنتر) دانشگاه زابل انجام شد. ریزومهاي نعناع فلفلی از کلکسیون گیاهان دارویی پژوهشکده کشاورزي دانشگاه زابل تهیه شد. ریزومهاي جوان در گلدانهایی به ابعاد در گلخانه تحقیقاتی پژوهشکده زیست فناوري کشت شوند. کشت ریزومها در عمق یک سانتیمتري از سطح خاك صورت گرفت. هر گلدان حاوي سه تا چهار ریزوم بوده و خاك گلدانها نیز مخلوط مساوي از خاك برگ و خاك هوموس بود. گلدانها در شرایط یکسان در دماي روزانه 25 تا 30 و شبانه 18 تا 20 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. آبیاري بصورت روزانه طوري که خاك گلدانها مرطوب باشد صورت گرفت. پس از دو تا سه ماه گیاه نعناع فلفلی آماده محلولپاشی و برداشت شد (2008 al.,.(soltani et فاکتورهاي آزمایش شامل زمان و تیمار بود که بخش هوایی نعناع مختلف برداشت شد. آب مقطر نیز به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت. استخراج منتول براي استخراج و اندازهگیري منتول بوتهها در دماي اتاق (حدود 25 درجه سانتیگراد) و در سایه خشک شوند و سپس با استفاده از دستگاه کلونجر و روش تقطیر با آب اسانسگیري شدند. تعیین منتول با استفاده از دستگاه GC/Mass انجام شد. از هر نمونه خشک شده 100 گرم آسیاب شد و به مدت دو ساعت با استفاده از روش تقطیر با آب اسانسگیري (Gerhart) و درصد آن تعیین شد. ترکیبهاي تشکیلدهنده فرجە تجاري توسط دستگاه کروماتوگرافی گازي مجهز به طیف سنج جرمی مدل Agilent 7890 (GC) گازي (کروماتوگرافی (GC/MS) متصل شده با طیف سنج جرمی (Mass) مدل (5975 (Agilent ستون HP-5MS و نیمه قطبی به طول 30 متر قطر داخلی ستون 0/25 میکرون دتکتور MS گاز حامل هلیوم (He) سرعت جریان گاز حامل یک میلیلیتر بر دقیقه برنامه حرارتی درجه سانتیگراد با سرعت 4 درجه سانتیگراد بر دقیقه و دماي محفظه تزریق 270 درجه سانتیگراد) در مو سسه دانش پژوهان تهران تجزیه شد. پس از تزریق اسانس به دستگاههاي نامبرده با استفاده از زمان بازداري ترکیبها (tr) اندیس بازداري (RT) طیف جرمی و مقایسه این پارامترها با ترکیبهاي استاندارد و یا با اطلاعات موجود در کتابخانه نسبت به شناسایی منتول اقدام شد. مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان

4 USA) (Themo, Wilmington, به روش طیف 2000 درصد کم ی این ترکیب نیز با محاسبه سطوح زیر منحنی در نانودراپ کروماتوگرافها محاسبه شد 2004) al.,.(ozturk et مطالعه بیان ژن منتون ردوکتاز سنجی انجام شد. پس از طیف سنجی به منظور همسانسازي غلظت cdnaهاي تولید شده رقیق سازي cdnaها با آب مقطر 300 ng/µl DNase استخراج RNA از برگهاي نعناع فلفلی بر اساس دستورالعمل فاقد به غلظت تقریبی صورت گرفت و پیشنهادي از کیت CinnaPure RNA (شرکت سیناژن ایران) غلظت نهایی توسط نانودراپ تایید شد. صورت گرفت. کمیت RNA کل به وسیله اسپکتوفتومتر و کیفیت آن توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد. سنتز cdna (دي.ان.ا شرکت 2-Steps RT-PCR kit معکوس) با استفاده از کیت ویوانتیس انجام گرفت. توالی ژن MR و ژن B-actin به عنوان ژن مرجع ) Housekeeping (gene از NCBI دانلود شد. طراحی آغازگرهاي اختصاصی ژن- هاي MR و B-actin با استفاده از نرم افزار Oligo Therapeutics و سایت Oligonucleotid Properties Calculator انجام گرفت. کمیت سنجی cdnaهاي ساخته شده با استفاده از دستگاه جدول 1- آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده ژنهاي منتون ردوکتاز و بتا اکتین Table 1- Specific primers designed genes of mentone reductase and beta-actin توالی آغازگرها دماي اتصال طول قطعه پی.سی.آر کد دسترسی Accession number Length of PCR product Annealing temperature AY AW Primer sequence F: 5 CGGGTTCGAGATATGCAGGCAG 3 (22mer) R: 5 GCAACAGCGCTAGCAGGGTCAG 3 (22mer) F: 5 GACCACCTCATGAAGATCTTAACC 3 (24mer) R: 5 ATTCTCGTAGTCCAAAGC3 (18mer) ژن Gene منتون ردوکتاز MR بتا اکتین B-actin تکثیر ژنهاي MR و B-actin بهمنظور اندازهگیري بیان ژن توسط واکنش Real time PCR بر اساس دستورالعمل پیشنهادي کیت HotTaq EvaGreen qpcr Mix (شرکت سیناژن ایران) صورت گرفت. تعیین کمیت نسبی در Real time PCR بهوسیله اندازه- بسط ترکیبی بود. الگویابی منحنی ذوب از 50 ت ا 99 درجه در پایان واکنش براي هر PCR جهت تشخیص اختصاصی بودن واکنش انجام شد. براي هر نمونه سه تکرار تکنیکی و دو تکرار بیولوژیکی وجود داشت که اغلب تفاوت آنها کمتر از 0/5 بود. Eva گیري افزایش تشعشع فلورسنس در نتیجه اتصال رنگ ) پس از انجام واکنش تکثیر به روش QReal time PCR دادههاي (RG-3000 Corbett Research) با استفاده از دستگاه (Green انجام شد. خام به صورت (Threshold cycle) Ct از دستگاه استخراج شد. براي هر نمونه سه تکرار در نظر گرفتهشد و از روش ΔΔCt براي برنامه حرارتی براي تکثیر هر دو ژن با استفاده از Real time تجزیهوتحلیل دادهها استفاده شد. PCR یکسان و شامل: 95 درجه به مدت 15 دقیقه جهت فعال سازي ابتدایی آنزیم طی 40 دوره سپس 95 درجه به مدت 30 ثانیه به منظور واسرشت شدن 58 درجه به مدت 45 ثانیه جهت اتصال آغازگرها و درنهایت 72 درجه به مدت 30 ثانیه جهت تجزیهوتحلیل آماري همه آزمایشها با سه تکرار و سه نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگینها با استفاده از نسخه 9/2 نرم افزار SAS و آزمون چند دامنهاي درسطح احتمال پنج درصد انجام شد. 4 مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان 1393

5 نتایج نتایج تجزیهوتحلیل در Real Time PCR تغییرهاي بیان ژن منتون ردوکتاز در سه زمان مختلف تحت تا ثیر منگنز و اسید سالیسیلیک اندازهگیري شد. منحنی تکثیر ژنهاي MR و B-actin با استفاده از Real Time PCR نشان دادند که تکثیر به خوبی و با عملکرد مناسب و بدون هیچگونه آلودگی صورت گرفته است (شکل 1). اثر اسید سالیسیلیک و منگنز بر بیان ژن MR در طول سه زمان نشان داد بیشترین میزان بیان ژن تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک در پنج روز بعد از اعمال تیمار بود که اختلاف معنیداري با سایر تیمارها داشت. کمترین بیان ژن نیز تحت تا ثیر منگنز در پن ج روز اثر منگنز و اسید سالیسیلیک بر میزان منتول ترکیب غالب اسانس بخش هوایی نعناع فلفلی در تحقیق حاضر در گروه شاهد و گروه تحت تیمار منتول بود. بررسی مقدار منتول تحت تا ثیر منگنز و اسید سالیسیلیک نشانداد که بیشترین میزان منتول در پنج روز بعد از اعمال تیمار و تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک بود درحالیکه کمترین میزان آن تحت تا ثیر منگنز مشاهده شد که اختلاف معنیداري با شاهد داشت. همچنین در سه روز بعد از اعمال تیمار اختلاف معنیداري بین منگنز و اسید سالیسیلیک با شاهد وجود داشت. از طرفی در پنج روز بعد از محلولپاشی نشان داده شد که اسید سالیسیلیک در اثر متقابل با منگنز تا حدودي باعث افزایش منتول شد اما این افزایش به اندازه اسید سالیسیلیک نبود. بعد از اعمال تیمار مشاهدهشد که منجر به کاهش معنیدار بیان ژن MR نسبت به شاهد شد (شکل 2). شکل 1- منحنی ذوب ژن.MR هر Peack نمایانگر یک محصول PCR است که اختصاصی بودن محصول را نشان میدهد. Figure 1- The melting curve of MR gene. Each Peack represents a PCR product that indicates specificity of the product. مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان

6 شکل 2- بیان ژن MR تحت تا ثیر منگنز و اسید سالیسیلیک در زمانهاي مختلف. حروف یکسان بیانگر عدم معنیداري درسطح پنج درصد است. Figure 2- Gene expression of menthone reductase under manganese and salicylic acid at different times. Similar letters are not significantly different at %5 probability. شکل 3- مقدار منتول تحت تا ثیر منگنز و اسید سالیسیلیک در زمانهاي مختلف. حروف یکسان بیانگر عدم معنیداري درسطح پنج درصد است. Figure 3- Rate of menthol under manganese and salicylic acid at different times. Similar letters are not significantly different at 5% probability. بحث ونتیجه گیري همانطور که در شکل دو مشاهده شد اسید سالیسیلیک بهعنوان القاء کننده بیان ژن عمل کرده و باعث افزایش معنیدار بیان ژن MR در پنج روز بعد از اعمال تیمار نسبت به شاهد شد درحالی- که منگنز به عنوان فلز سنگین کاهش معنیدار بیان ژن MR در همان زمان را باعث شد. در مقایسه بیان ژن MR با میزان منتول تحت تا ثیر منگنز مشاهده شد که با کاهش بیان ژن MR میزان منتول هم کاهش پیدا کرد که با تحقیقات Davis و همکاران (2005) و همچنین Kjonnas و همکاران (1982) در مورد اینکه 6 مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان 1393

7 بیان ژن MR تا ثیر مستقیمی در تولید منتول داشته است مطابقت دارد. Zarinkamar و همکاران (2012) پژوهشی را با عنوان بیان ژن لیمونن سنتاز تحت غلظتهاي مختلف منگنز در گیاه زیره انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که منگنز در غلظتهاي پایین (20 و (ppm 40 باعث افزایش بیان ژن لیمونن سنتاز میشود درحالیکه در غلظت بالا (160 (ppm باعث کاهش معنیدار بیان آن ژن میشود. در این بررسی نیز با توجه به بالا بودن غلظت منگنز و در نتیجه سمی بودن آن به عنوان فلز سنگین مشاهده شد که این عنصر باعث کاهش بیان ژن MR و در نتیجه میزان منتول گیاه نعناع فلفلی شد. در توجیه این نتیجه اینگونه میتوان بیان کرد که با توجه به اینکه منگنز (در غلظتهاي بسیار پایین) به عنوان یک ریزمغذي بر بیوسنتز لیمونن که ابتداییترین مونوترپن حلقوي در مسیر بیوسنتزي مونوترپنها بوده و نقش پیشساز جهت تولید بخش عمدهاي از ترکیبهاي ترپنی دارد به اثبات رسیده است( 2001 al., (Maruyama et اما در این بررسی احتمالا به دلیل غلظت بالاي منگنز و در نتیجه سمی بودن آن به عنوان فلز سنگین در ترکیب بیوسنتزي منوترپنها و به طبع آن کاهش میزان منتول نقش عکس را بر بیوسنتز منوترپنها داشته و در نتیجه باعث کاهش بیان ژن MR و میزان منتول شده است. همچنین بررسی نتایج بیان ژن MR در گیاه.M Piperita تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک نشان داد که این هورمون در پنج روز بعد از اعمال تیمار نقش القاءکننده داشته و باعث افزایش معنیدار بیان ژن MR نسبت به شاهد شد. بیان ژن MR تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک به عنوان یک ماده علامترسان کلیدي که در فعال- سازي پاسخهاي دفاعی گیاهان شرکت میکند افزایش یافت (1997 al.,.(durner et اسید سالیسیلیک در تنظیم و ایجاد علامتهایی براي تجلی ژنها در زمان پیري در گیاه آرابیدوبسیس Morris et al., ) دخالت دارد (Arabidopsis thaliana) 2000). Taguchi و همکاران (2001) در پژوهشی نشان دادند اسید سالیسیلیک موجب افزایش بیان ژنهاي مربوط به بیوسنتز و تولید گروهی از متابولیتهاي ثانویه در گیاهان میشود. با توجه به نقش اسید سالیسیلیک در القاء بیان ژن در این تحقیق نیز مشاهده شد که اسید سالیسیلیک باعث افزایش بیان ژن MR شد. مقایسه بیان این ژن با میزان منتول نشان داد که با افزایش بیان ای ن ژن تحت تا ثیر اسید سالیسیلیک در سه و پن ج روز بعد از اعمال تیمار میزان منتول هم افزایش یافت. در اثر متقابل منگنز و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن MR در سه و پنج روز بعد از اعمال تیمار مشاهده شد که اسید سالیسیلیک تا حدودي از اثر منفی منگنز بر بیان ژن MR کاسته و باعث تعدیل سمیت ناشی از منگنز شد به- طوريکه در میزان منتول نیز این افزایش مشاهده شد که با پژوهش Hashemi و همکاران (2012) مطابقت دارد. پژوهشهانشان داده است که عوامل محیطی و استرسزا همواره ترکیب شیمیایی و اسانس گیاهان را تحت تا ثیر قرار میدهند (2003 Warman,.(Zheljazkov and در تحقیق حاضر هر چند منگنز باعث افزایش کلی اسانس شد اما این تنش باعث کاهش میزان منتول (بیشترین ترکیب اسانس نعناع فلفلی) اسانس شد که میتوان دلیل آن را کاهش بیان ژن منتون ردوکتاز تحت تا ثیر غلظت بالاي منگنز دانست. غلظت بالاي منگنز ممکن است با کاهش محتواي کلروفیل و یا فتوسنتز همراه شده ) et Chatterjee (al., 2006 و بدین ترتیب از یکسو به کاهش رشد و از سوي دیگر به کاهش میزان فراهم شدن برخی پیشسازهاي ترکیب ه اي فنلی مورد نیاز مانند منتول براي سنتز اسانسها منتهی شود. در این تحقیق مشخص شد بیان ژن MR تا ثیر مستقیمی با تولید منتول در گیاه نعناع فلفلی دارد بهطوريکه با افزایش بیان ژن MR میزان منتول نیز افزایش یافت در حالی که با کاهش بیان این ژن درصد منتول نیز کاهش نشان داد. همچنین باتوجه بهاینکه تنش ناشی از فلزات سنگین به خصوص منگنز بهعنوان یک عامل سمی و محدودکننده در بیان ژن و تولید اسانس است بنابراین مقابله با این تنشها از اهمیت ویژهاي برخوردار بوده که در این تحقیق با توجه به خواص القاءکنندگی و هورمونی اسید سالیسیلیک نقش این ترکیب بر تعدیل تنش حاصل و همچنین افزایش بیان ژن و تولید منتول ضروري بوده و توانسته اثرات مخرب منگنز را مهار مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان

8 کند. بنابراین با در نظر گرفتن خواص دارویی منتول و ارزش اقتصادي آن در صنایع داروسازي بهداشتی و آرایشی میتوان افزایش تولید آن را از طریق افزایش بیان ژن منتون ردوکتاز تحت تا ثیر الیسیتورهاي دیگر در پژوهشهاي آینده پیشنهاد نمود. منابع Bauer K, Garbe D and Surburg H Common fragrance and flavor materials. Wiley-VCH, New York, NY, pp Blamey FPC, Joyce DC, Edwards DG and Asher CJ Role of trichomes in sunflower tolerance to manganese toxicity. Journal of Plant and Soil Science 91(2): Bupesh G, Amutha C, Nandagopal S, Ganeshumar A, Sureshkumar P and Murali K.S Antibacterial activity of Mentha piperita L. (Peppermint) from leaf extracts a medicinal plant. Acta Agriculturae Slovenica 89(1): Chatterjee C, Gopal R and Dube BK Impact of iron stress on biomass, yield, metabolism and quality of potato (Solanum tubersum L.). Science Horticulturae 108: 1-6. Croteau RB, Davis EM, Ringer KL and Wildung MR ( )-Menthol biosynthesis and molecular genetics. Naturwissenschaften 92(12): Davis EM, Ringer KL, McConkey ME and Croteau R Monoterpene metabolism. Cloning, expression, and characterization of menthone reductases from peppermint. Plant physiology 137(3): Durner J, Shah J, Klessig DF Salicylic acid and disease resistance in plants. Trends Plant Science 7: Gershenzon J, Maffei M and Croteau K Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichome of spearmint (Mentha spicata). Plant physiology 89: Grattan SR and Grieve CM Salinity-mineral nutrient relations in horticultural crops. Science Horticulturae 78: Haji boland R and Khosropanah MK Manganese toxicity tolerance in plants, sunflower, rice and maize in hydroponic conditions. Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 9(4): [In Farsi with English abstract] Hashemi SH, Asrar Z and Pourseydi SH Effect of Pretreatment of seeds with salicylic acid on manganese toxicity in Lepidium sativum L. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 28(2): [In Farsi with English abstract] He Y, Liu Y, Cao W, Huai M, Xu B and Huang B Effects of salicylic acid on heat tolerance associated with antioxidant metabolism in Kentucky bluegrass. Journal of Crop Science 45(3): Kjonaas R, Martinkus-Taylor C and Croteau R Metabolism of monoterpens: Conversion of l- menthone to l-menthone and neomenthol by sterospecific dehydrogenases from peppermint (Mentha piperta) leaves. Plant physiolology 69: Klayman DL Qingbaosu (artemisinin): An antimalarial durg from China. Science 228(4703): Maruyama T, Ito M, Kiuchi F and Honda G Molecular cloning, functional expression and characterization of d- Limonene synthase from Schizonepeta tenuifolia. Biological & pharmaceutical bulletin 24(4): Macro J.A. and Barbera O Natural products from the genus Artemisia L. Stud. Nat. Prod. Chem. 7: Morris K and Mackerness SAH Salicylic acid has a role in regulating gene expression during leaf senescence. The Plant Journal 23(5): Ozturk A, Unlukara A, Ipek A and Gurbuz B Effects of Salt Stress and Water Deficit on Plant Growth and Essential oil Content of Lemon Balm (Melissa officialis L.). Pak. J. Bot 36(4): Sayyari M, Babalar M, Kalantari, S, Serrando M and Valero D Effect of salicylic acid treatment on reducing chilling injury in stored pomegranates. Postharvest Biology Technology, 53: Singh R, Shushni AM, Belkheir A Antibacterial and antioxidant activities of Mentha piperita L. Arabian Journal of Chemistry 1: 1-5. Soltani F, Sharifi M, Khajeh K, Yousefzadi M Study of essential oil composition, menthone reductase activity and antimicrobial activity of Mentha piperita in two stages of growth. Iranian Journal of Biology 21 (5): [In Farsi with English abstract] Taguchi G, Yazawa T, Hayashida N, Okazaki M Molecular cloning and heterologous expression of novel glucosyltransferases from tobacco cultured cells that have broad substrate specificity and are induced by salicylic acid and auxin. European. Journal of Biochemistry 268(14): Zarinkamar F, Ghannadnia M, Haddad R Limonene synthase gene expression under different concentrations of manganese in Cuminum cyminum L. African Journal of Plant Science 6(6): Zheljazkov VR, Warman PH Application of high Cu compost to Swiss chard and basil. The Science of the Total Environment 302(1): مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی/ دوره سوم/ شماره 1/ بهار و تابستان 1393